La histología, una parte fundamental de la investigación biomédica, se encarga de estudiar la estructura, composición y características de los tejidos orgánicos de los seres vivos. Con esta intención se utilizan diferentes técnicas de microscopía que permiten observar las muestras biológicas con alta resolución. Sin embargo, dado que la luz, por sus propiedades físicas, no consigue penetrar en secciones gruesas de tejido, el análisis al microscopio requiere procesar los tejidos de tal manera que puedan ser cortados en láminas de pocas micras de grosor.
Mediante este procesado y laminado del tejido la histología deja a un lado la tridimensionalidad de las muestras biológicas, perdiendo por tanto una gran cantidad de información. Un ejemplo claro es el del tejido nervioso donde una sola neurona puede desplegarse en muchas direcciones y donde una fina sección de tejido es incapaz de aportar dato alguno sobre su naturaleza real.
Además, el estudio de la organogénesis (formación embrionaria de los órganos) requiere igualmente de una visión espacial en tres dimensiones. Solo esto permite trazar los cambios morfológicos que se producen en diferentes regiones de un determinado órgano o tejido durante el desarrollo, como ocurre en el estudio sobre el origen y la formación de la vasculatura cardiaca.
Por su utilidad, se ha dedicado mucho esfuerzo a desarrollar técnicas que posibiliten una visualización directa en tres dimensiones de las muestras biológicas, sin realizar modificaciones estructurales. Inicialmente, como solución de compromiso, se laminaba el tejido por completo tomando al mismo tiempo imágenes de las secciones obtenidas para así poder reconstruir el tejido inicial en 3D por métodos informáticos. Aunque esta idea es útil y genera reconstrucciones fiables, es también laboriosa y técnicamente muy compleja. Por su parte, la microscopía también evolucionó y sobre los años cincuenta la denominada microscopía confocal permitió iluminar el tejido por planos sin necesidad de cortes. Sin embargo, los límites de la luz, incapaz de penetrar más allá de pocos cientos de micras, hacían imposible la adquisición de órganos enteros que fácilmente alcanzan varios milímetros de grosor. En este límite, una idea originada un siglo atrás pero olvidada durante varias décadas resurgió con fuerza: la clarificación tisular.
Técnicas de transparentado
Fue el anatomista alemán Werner Spalteholz, nacido en 1861, el pionero de las técnicas de transparentado a inicios del siglo XX. Sin embargo, sus ideas y experimentos no fueron retomados hasta finales del mismo siglo cuando pudieron ser complementados con técnicas de microscopía y de adquisición de datos apropiadas.
Para desarrollar estas técnicas, Spalteholz se basó en el comportamiento físico de la luz. La teoría nos dice que la luz viaja por el vacío a una velocidad constante conocida, pero cuando encuentra un objeto repleto de átomos, es decir, un nuevo medio por el que viajar, le es inevitable interaccionar con ellos (más en concreto con los electrones de estos átomos). Debido a esto la luz cambia su velocidad (cambiando por tanto su trayectoria) y dada la heterogeneidad de moléculas que encuentra, sufre lo que denominamos esparcimiento. En esta situación, la luz no será capaz de atravesar el objeto o lo hará sufriendo cambios de trayectoria. Seremos por tanto incapaces de ver aquello que haya tras él o su propia estructura interna. A estos cuerpos les denominamos opacos o translúcidos y esto es, a groso modo, lo que ocurre con las muestras biológicas.
Spalteholz llegó a la conclusión de que debía conseguir que el tejido biológico a estudiar afectase mínimamente a la luz que lo atravesaba. Para ello, fijó primero su atención en el denominado índice de refracción. Esta medida, referida en física como “n”, es la razón entre la velocidad de la luz en el vacío llamada “c” y la velocidad de la luz «v», en el medio del cual calculamos la «n».
Así, que dos medios difieran en su valor de n, siendo c constante, significará que la velocidad de la luz viajando en cada uno de ellos es diferente, obteniendo el caso anteriormente definido en el que la luz sufre un cambio de trayectoria haciendo difícil la observación interna de la muestra. Sin embargo, dos medios con el mismo valor para n serán atravesados por la luz a una misma velocidad y, por tanto, sin modificar su trayectoria. Sabiendo esto, Spalteholz determinó que la composición química de la propia muestra debía ser lo más parecida posible en el índice de refracción al medio que la contuviese, haciendo así que la luz que viajase por el medio, al encontrar la muestra, continuase una trayectoria rectilínea. Con ello, solucionó igualmente el fenómeno de esparcimiento, pues si este es producido por la heterogeneidad de moléculas, el hecho de igualar las composiciones químicas de muestra y medio, generará una homogeneidad que reduzca el esparcimiento.
Entendidas las bases físicas, Spalteholz abordó la idea experimental con un protocolo sencillo pero efectivo: sustituir componentes “molestos” de las muestras biológicas por la misma sustancia química que las contuviese. Primero, Spalteholz deshidrataba la muestra con etanol, eliminando de su composición el agua a la vez que retiraba ciertos pigmentos del propio tejido con peróxido de hidrógeno, conocido comúnmente como agua oxigenada. Segundo, eliminaba con disolventes orgánicos (como el benceno) los lípidos, unas moléculas presentes en abundancia y que causan la mayor parte de la refracción de la luz. Por último, embebía el tejido en una sustancia de alto índice de refracción, para intentar igualar el índice que le quedaba a la propia estructura. Según sus cálculos la mejor solución para igualar el índice de refracción era una mezcla de salicilato de metilo, benzoato de bencilo y aceites vegetales.
Tras esto, siempre que la muestra se encuentre en el medio de la sustancia con la que se ha embebido, la luz la atravesará de forma rectilínea y sin esparcimiento, dando como resultado la transparencia. En el siguiente video puedes ver una demostración práctica de la igualación del índice de refracción entre una muestra y el medio que la contiene:
.
Spalteholz fue capaz de transparentar eficientemente ciertos tejidos y dejó asentadas las bases de la clarificación tisular. Conforme la química ha ido avanzando, los productos para clarificar las muestras han mejorado y han superado ciertas limitaciones como la agresividad contra la muestra o la toxicidad.
Ahora utilizamos elementos como el tetrahidrofurano para la deshidratación del tejido, el diclorometano para la eliminación de lípidos o el dibencil éter para embeber la muestra igualando índices de refracción y generando la transparencia. Además, las nuevas técnicas de microscopía permiten adquirir estos tejidos transparentados con alta resolución y de manera rápida y eficiente, mientras que las técnicas informáticas permiten aunar y manejar todos los datos para obtener una información nunca vista en el área de la histología.
Bibliografía consultada
-Manuel Megías Pacheco, Pilar Molist García, Manuel Ángel Pombal Diego. Atlas de histología vegetal y animal. Departamento de Biología Funcional y Ciencias de la Salud. Facultad de Biología. Universidad de Vigo.
-Richardson DS, Lichtman JW. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 2015 Jul 16;162(2):246-57.
-GATAN, 3View System. Media Library.
-María Dolores Morales García. Uso de la fluorescencia y la microscopía confocal en la investigación científica. Rincón del profesor de ciencias, Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular. Julio de 2012.
-Cluster, Divulgación científica. El Vaso que desaparece.
-Ciencia Políticamente Incorrecta. Esparcimiento de la luz. 12 Octubre 2015.
-Azaripour A, Lagerweij T, Scharfbillig C, Jadczak AE, Willershausen B, Van Noorden CJ. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Prog Histochem Cytochem. 2016 Aug;51(2):9-23.