Más que la suma de las partes

Los seres vivos están constituidos por cientos de miles de moléculas distintas; las proteínas son un tipo de ellas. Estudiar y comprender su estructura y los modos en que interaccionan dentro de las células constituyen algunos de los roles de la biología estructural.

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¿Qué hacemos cuando nos levantamos a la mañana? Habitualmente, después de escuchar el despertador, dejamos la cama, nos duchamos, tomamos unos mates y salimos corriendo. ¿Corriendo hacia dónde? En la semana, yo voy al laboratorio. Otras personas van a una fábrica o a cualquier otro trabajo. También salimos a hacer deporte. Otras veces salimos a festejar con amigos. Nuestro cuerpo y sus posibilidades, como los mecanismos de la audición, las propiedades de nuestras fibras musculares, nuestra capacidad para interactuar con otros seres vivos y con el entorno, está codificada en el ADN. Así, hemos construido submarinos, pero no podemos respirar bajo el agua. Por otro lado, corremos y socializamos, y en torno a estas posibilidades hemos inventado juegos como el fútbol.

¿Qué es el ADN?

El ADN es una molécula, una entidad química. ADN es la abreviatura de Ácido DesoxirriboNucleico. Todos los seres vivos tenemos ADN. Cuando comemos, comemos también ADN. El ADN, como cualquier cosa que ocupe un lugar en el espacio, tiene forma. Sí, el ADN toma la forma de una doble hélice. Esa forma le permite cumplir con su función, que es almacenar la información genética y transferirla a la siguiente generación.

El ADN codifica para un programa con múltiples posibilidades, las cuales se extienden en el espacio y en el tiempo. El conocimiento de la naturaleza, la función y la estructura del ADN es la base de los análisis de filiación. En Argentina los utilizamos, entre otros casos, para determinar el parentesco entre abuelas y nietos.

A mediados del siglo pasado, la científica Rosalind Franklin encontró evidencia clave acerca de la estructura en forma de doble hélice del ADN. A pesar de que esta información fue esencial para entender los mecanismos del almacenamiento y de la transferencia de la información genética, Rosalind no recibió un premio Nobel por sus hallazgos (aún actualmente las mujeres no reciben todo el crédito que merecen por sus trabajos, te lo puedo demostrar otro día).

En sus estudios sobre la estructura del ADN, Rosalind utilizó la técnica de difracción de rayos X, uno de los pilares de la biología estructural moderna. Esta rama de la biología estudia la forma tridimensional de las moléculas biológicas, o sea, de las moléculas que nos componen. La idea es simple: si conocemos las formas de los engranajes de una máquina, eventualmente vamos a entender cómo funciona. Como pasó con el ADN.

Estructura del ADN. (A) Modelo molecular propuesto por James Watson y Francis Crick, representación con cintas y varillas. (B) Prueba experimental de la estructura del ADN obtenida por Rosalind Franklin mediante difracción de rayos X. La información acerca de la pendiente de la hélice (α), su período (p) y la distancia entre los pares de bases nitrogenadas (b) se encuentra en el patrón de difracción registrado bajo el nombre de Fotografía 51. Adaptado de Watson & Crick (1953, Nature) y Franklin R & Gosling R (1953, Nature).

¿Cuáles son los componentes de los seres vivos?

Ahora bien, ¿de qué están hechas las células? Están compuestas por cuatro tipos de moléculas fundamentales: los ácidos nucleicos, los azúcares, los lípidos y las proteínas. Entre los primeros, el ADN, como ya dijimos, carga la información genética y codifica un ‘programa’. Los azúcares y los lípidos (o grasas) forman parte de las células como los ladrillos forman parte de la estructura de una casa. De hecho, se los encuentra en las membranas celulares y en la pared celular. Además, son las principales fuentes de energía. Son parte del combustible que ingerimos en la dieta. Las proteínas, el cuarto y último componente, también forman parte de nuestra alimentación y son fuentes de energía. Además de ello, prácticamente todas las funciones celulares implican la acción de algún conjunto particular de proteínas. Podemos pensar en las proteínas como en las ‘obreras’ de la célula. No sólo llevan a cabo todos los trabajos allí necesarios, sino que además construyen la célula, la reparan, la comunican con el medio, median su multiplicación e, incluso, marcan el cese de todas estas actividades.

La arquitectura tridimensional de las proteínas

Las proteínas toman formas muy variadas en el espacio. Dichas formas son específicas para cada proteína y esto constituye uno de los principales focos de atención de la biología estructural. La estructura tridimensional de las proteínas está íntimamente ligada a las funciones que éstas cumplen. Pueden ser transportadoras, funcionar como receptores, tener roles estructurales, entre otros. Por ejemplo, en la parte izquierda de la imagen inferior (A) podemos ver una representación de una bacteria con flagelo. En la membrana se insertan proteínas trans-membrana: con una porción hacia el exterior de la célula, otra que atraviesa la membrana, y otra en el interior celular. Proteínas de este tipo funcionan como receptores, monitoreando las condiciones del medio, como transportadores, mediando el ingreso de diversos compuestos al interior de la célula, o como parte de la maquinaria involucrada en la construcción de la pared celular. Por otro lado, en la parte derecha de la imagen (B) vemos la cápside (cubierta externa) de un virus. Su geometría depende, entre otras cosas, de que un grupo particular de proteínas formen algo parecido a una estrella de cinco puntas. Si estas proteínas tuviesen defectos en su estructura, su función quedaría afectada.

Estructura tridimensional de las proteínas. (A) Estructuras moleculares de componentes bacterianos determinadas mediante tomografía. Se pueden observar las proteínas tras-membrana insertadas en las membranas celulares, las proteínas del flagelo y los ribosomas (complejos de proteínas y ácidos nucleicos dedicados a la síntesis de proteínas). (B) Estructura molecular de un enterovirus bovino (código PDB 1BEV,). En colores se muestran las proteínas de su cubierta externa.

¿Cómo se estudia la estructura 3D de las proteínas?

La biología estructural cuenta principalmente con tres técnicas para el estudio de la arquitectura 3D de las proteínas: la resonancia magnética nuclear, la microscopía electrónica y la cristalografía de proteínas por difracción de rayos X.

Las tres técnicas permiten obtener información a resolución atómica. Aquí la palabra ‘resolución’ tiene exactamente el mismo significado que el que le damos en el contexto de las cámaras fotográficas. Sabemos que para tener fotos más detalladas necesitamos más megapíxeles. Cuando hablamos de ‘resolución atómica’ significa que queremos tener información precisa y exacta acerca de la posición de los átomos en el objeto que estamos investigando. Entonces, si nos interesa estudiar los átomos de la materia, necesitamos interactuar (algo así como ver) con los núcleos o los electrones que los componen. La resonancia magnética nuclear utiliza imanes para interactuar con los núcleos atómicos. La microscopía electrónica y la cristalografía de proteínas por difracción de rayos X se basan en interacciones con los electrones que rodean a los núcleos de los átomos. En el primer caso, para ver se utilizan, justamente, electrones, y en el otro, rayos X. Aquí vamos a centrarnos en éste último (No me abandones, vas a ver que, después de todo, esto no es tan raro).

¿Qué son los rayos X?

Los rayos X son las radiaciones que usamos para tomarnos radiografías. Pueden ser entendidos como ondas y forman parte del espectro electromagnético.

Éste conjunto de radiaciones abarca las radiofrecuencias (radios AM y FM, televisión), las microondas (teléfonos móviles, hornos microondas), la radiación infrarroja (radiadores para calefacción), la luz visible (visible por el ser humano, los ojos de otros animales ven otras radiaciones), los rayos ultravioleta (nos protegemos de ellos usando protectores solares), los rayos X (radiografías) y los rayos gama (fuentes radioactivas).

Estas radiaciones tienen diferentes longitudes de onda, entendiendo a la ‘longitud de una onda’ como la distancia entre dos de sus crestas o dos de sus valles. La longitud de onda de los rayos X es similar al tamaño de los átomos. Por eso, utilizamos esta radiación para estudiar los átomos y sus enlaces.

El espectro electromagnético. La longitud de onda disminuye desde las radiofrecuencias hacia los rayos gama.

¿Cómo se hace un experimento de difracción de rayos X para estudiar la estructura de una proteína?

Para comprenderlo necesitaremos tener en claro una serie de cuestiones como: la muestra a estudiar, su ordenamiento, las características de los rayos X y la manera en que ellos interaccionarán con la muestra. Vayamos por partes.

Radiografía de la mano con un anillo ,de un anatomista, publicada por Wilhelm Röntgen en 1895. Fuente: Röntgen WC (1895). Über eine neue Art von Strahlen.

En primer lugar, necesitamos la proteína que vamos a estudiar y una fuente de rayos X. Enseguida podemos imaginar un diseño experimental no muy diferente al de la adquisición de una placa radiográfica. Así, dispondríamos de la fuente de rayos X, en el extremo opuesto colocaríamos un detector (la placa radiográfica) y entre ambos ubicaríamos la muestra en estudio. Lo que se ve en la placa radiográfica, una vez que los rayos X atraviesan un objeto, es la sombra del objeto que se encuentra en el camino de los rayos X.

Vayamos al caso de una radiografía corporal. Los huesos, debido a su constitución, son más densos en electrones que los músculos. Por eso, el tejido óseo atenúa más los rayos X e impide que éstos lleguen a la placa. Lo que ocurre es que parte de la radiación es dispersada. Pasa lo mismo que cuando iluminamos niebla o cuando la luz del sol atraviesa las nubes: la luz se encuentra con las partículas (de agua en este caso) en el aire y, en vez de seguir un camino recto, es desviada en distintas direcciones. De modo similar, los rayos X son dispersados por los electrones de una muestra y, en este proceso, llevan información sobre la posición relativa de los átomos en la materia irradiada.

¿Qué pasa con las proteínas? Es posible analizar la dispersión de rayos X por una única molécula de proteína, pero técnicamente es muy difícil. Básicamente, es muy difícil medir la dispersión de rayos X por un objeto tan pequeño. Entonces, lo que en general hacemos quienes trabajamos en biología estructural es preparar un cristal de la proteína que vamos a estudiar. Sí, un cristal de proteína, como el que se ve en el panel izquierdo de la figura de abajo; similar a los cristales de azúcar o de sal que agregamos a la comida. ¿Por qué usamos cristales de la proteína? Porque así podemos tener juntas miles de moléculas iguales. Además, básicamente, porque un cristal es algo que podemos manejar con nuestras manos. En los cristales las moléculas están ordenadas. ¿Cómo? Como cajas apiladas, como se ve en la figura de abajo.

Cristales de proteína. Izquierda: fotografía de cristales de proteína. Centro: cada cristal es un arreglo tridimensional ordenado de moléculas. Se muestra una molécula de proteína en el cristal. Derecha: estructura de un cristal de una proteína bacteriana. Adaptado de formulatrix.com y Lisa M et. al. (2015, Structure).

Cuando iluminamos un cristal con rayos X los electrones dispersan la radiación. Las ondas dispersadas se suman en algunas zonas y se cancelan en otras. Algo similar ocurre cuando arrojamos dos piedras en un estanque de agua, como se ve en panel izquierdo de la figura de abajo. Las posiciones donde las ondas se suman o se restan van a depender del espaciado de los electrones en el cristal o, en el otro caso, de la distancia a la que caigan las piedras en el agua. Además, la intensidad de los máximos va a estar dada por la cantidad de electrones en la proteína o por la fuerza a la que arrojemos las piedras. En nuestro experimento con rayos X, esto queda registrado en un detector y se llama patrón de difracción. En el panel derecho de la figura de abajo se muestra uno.

Interferencia entre ondas. (A) Interferencia de ondas en el agua. Aparecen zonas de interferencia constructiva (máximos o crestas) y de interferencia destructiva (mínimos o valles). (B) Patrón de difracción de un cristal de proteína originado por la interferencia de rayos X dispersados. Los máximos quedan registrados como puntos negros.

Bien, ya casi lo tenemos. En el siguiente video podemos ver, finalmente, cómo se lleva a cabo un experimento de difracción de rayos X para conocer la estructura de una proteína. En resumen, el cristal se coloca en el camino de los rayos X y su patrón de difracción se colecta en un detector. A partir de éste, y empleando una operación matemática que se llama transformación de Fourier, es posible conocer la distribución espacial de los electrones de la proteína.

Experimento de difracción de rayos X para un cristal de proteína. Se muestran las etapas descritas en el texto para el estudio de una proteína del virus de la rubeola. Adaptado de www.synchrotron-soleil.fr

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Fuente: wikimedia commons.

¿Cuál es el resultado del experimento? Un mapa 3D de la densidad electrónica del cristal.

Ahora bien, como los electrones se encuentran en torno a los núcleos atómicos, podemos inferir la posición de estos últimos a partir de la densidad electrónica. Así, podemos dibujar los átomos del cristal de proteína. Por eso, esta técnica se llama “cristalografía de proteínas por difracción de rayos X”. Al completar el dibujo del cristal de proteína empezamos a conocer la estructura de la proteína que formó el cristal. El dibujo se llama modelo y es lo vemos en las imágenes de este artículo donde aparecen representaciones 3D de proteínas y también en el video.

Los modelos de las distintas proteínas estudiadas por esta técnica, en laboratorios de todo el mundo (¡incluido Rosario, en Argentina!), se encuentran disponibles en el Banco de Datos de Proteínas o Protein Data Bank (PDB).

Comprender las interacciones de las moléculas que nos componen

Actualmente, uno de los mayores desafíos de la biología estructural es entender cómo interactúan las distintas proteínas en una célula.

La vida no puede explicarse a partir de sus constituyentes individuales. Sus propiedades emergen justamente a partir de las interacciones entre las moléculas que nos componen. Por ejemplo, en las células han evolucionado mecanismos para monitorear qué alimentos se encuentran disponibles en el medio y, así, prepararse para metabolizarlos. Estos sistemas habitualmente involucran decenas de proteínas distintas y la formación de complejos entre las mismas es esencial para la correcta decodificación de la información medioambiental.

La biología estructural tiene mucho para aportar a la comprensión de procesos como los que se comentan arriba. Sin embargo, más interesante es el horizonte que aparece al pensarla como uno de distintos abordajes que se integran al estudio de la biología. Ciertamente, se hacen numerosos esfuerzos en esta dirección, sumando también las contribuciones de la genética, la bioquímica, la biofísica y la ciencia de datos, entre otras disciplinas.

De nuevo, lo más interesante parece emerger en las interfaces. Estas estrategias colaborativas nos permitirán conocer más y mejor cómo somos y cómo interactuamos con otros seres vivos y con el entorno. Son muy atractivas las perspectivas con respecto al edificio que podríamos construir de esta manera.

Referencias bibliográficas:

  • Franklin RE y Gosling RG (1953). Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature 171, 740.
  • Watson JD y Crick FHC (1953). Molecular structure of nucleic acids. Nature 171, 737.
  • Milne JLS y Subramaniam S (2009). Cryo-electron tomography of bacteria: progress, challenges and future prospects. Nature Reviews Microbiology 7, 666.
  • Smyth M et. al. (1995). Implications for viral uncoating from the structure of bovine enterovirus. Nature Structural and Molecular Biology 2, 224.
  • Röntgen WC (1895). Über eine neue Art von Strahlen.
  • Lisa MN et.al. (2015). Molecular basis of the activity and the regulation of the eukaryotic-like S/T protein kinase PknG from Mycobacterium tuberculosis. Structure 23, 1039
  • formulatrix.com
  • www.synchrotron-soleil.fr

Licenciada en Biotecnología y Doctora en Ciencias Biológicas. Graduada en la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas de la Universidad Nacional de Rosario. Investigadora adjunta de CONICET. Directora de la Unidad de Cristalografía de Proteínas del Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR). Twitter: @MaNataliaLisa

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