Recreando tumores en el laboratorio: los cultivos 3D

Para la evaluación preclínica de candidatos a nuevos fármacos para tratar el cáncer es imprescindible contar con modelos de estudio que predigan la respuesta clínica de manera más confiable. Se busca contar en el laboratorio con modelos que logren simular el comportamiento real de un tumor.

Tiempo de lectura: 8 minutos

El cáncer es actualmente una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo y es el resultado final de la interacción de múltiples factores. En condiciones normales, las células se dividen de manera ordenada cuando el cuerpo las necesita y mueren cuando se dañan o cuando el cuerpo ya no las requiere, siendo reemplazadas por nuevas células. En diferentes situaciones, algunas células pueden comenzar a dividirse sin control, sin respetar las señales que le indican que deben morir, formando una masa anormal de tejido (tumor). Los tumores son cancerosos (malignos) o no cancerosos (benignos) y pueden originarse en cualquier parte del cuerpo. Los primeros son capaces de invadir tejidos cercanos o incluso trasladarse y proliferar en tejidos lejanos, en un proceso conocido como metástasis.

En el campo de la oncología, la rama de la medicina especializada en el diagnóstico y tratamiento del cáncer, las líneas celulares de origen tumoral son la primera estrategia utilizada (y la más empleada) para estudiar la biología del tumor y para evaluar nuevos fármacos y sus posibles mecanismos de acción. Estas líneas se generan a partir de células tumorales aisladas de una muestra de tejido tumoral de un paciente (biopsia), que posteriormente se cultivan y se preparan para poder ser mantenidas de forma indefinida en el laboratorio. Si bien algunos laboratorios generan sus propias líneas celulares, la mayoría las adquiriere comercialmente.

Los cultivos en dos dimensiones: el punto de partida para estudiar el cáncer humano

Las líneas celulares obtenidas a partir de tumores sólidos tienen la capacidad de adherirse a un soporte como el plástico, con lo cual pueden cultivarse en placas de este material. Las células crecen entonces formando una “monocapa” sobre el plástico (cultivo en 2 dimensiones o 2D).

Para realizar este tipo de cultivos celulares se trabaja en una sala de cultivo especializada, en condiciones “controladas” y bajo estricta esterilidad, para evitar que las células se contaminen (por ejemplo, con bacterias). Se emplea un medio de cultivo que contiene todos los nutrientes que la célula tumoral necesita para sobrevivir y proliferar, y las mismas se mantienen en una estufa de cultivo a 37 °C con una atmósfera húmeda de 95 % O2 y 5 % CO2. Estos cultivos se emplean para realizar múltiples ensayos en el laboratorio, entre ellos para testear candidatos a nuevos fármacos.

En el panel superior se muestra el interior de una cabina de flujo laminar que contiene material de cultivo. Dicha cabina mantiene las condiciones de asepsia necesarias para trabajar. En el panel inferior izquierdo se muestran frascos y placas de plástico que contienen células adheridas en crecimiento. En el panel inferior derecho se muestra una micrografía de un cultivo 2D de una línea celular de cáncer de hígado.

Las líneas celulares tumorales se pueden mantener en cultivo durante largos períodos de tiempo, constituyendo una fuente ilimitada de células tumorales. Son fáciles de manipular, pueden ser modificadas genéticamente y en general conservan las propiedades del tejido de origen y la mayoría de los marcadores que se expresan en un tumor.

Sin embargo, existen ciertas limitaciones al intentar extrapolar los resultados obtenidos utilizando líneas celulares a la situación de un tumor real. Cada línea celular expresa un conjunto particular y único de genes y, por lo tanto, cada una puede responder diferente a un mismo fármaco, siendo necesario emplear más de una línea celular del mismo tipo de cáncer para los estudios. Por otro lado, al conformarse únicamente por un tipo de célula, la tumoral, los cultivos no reflejan las interacciones que se dan entre el tumor y su entorno, como tampoco pueden representar la exposición real del tumor a un medicamento, ya que otras células del ambiente tumoral pueden metabolizar o bloquear el acceso del fármaco a la célula maligna.

Sumado a esto, en los cultivos 2D las células crecen adhiriéndose al plástico de las placas y las interacciones célula-plástico prevalecen sobre las interacciones célula-célula. Además, estos cultivos carecen de la organización en 3D de los tumores y, muchas veces, muestran una expresión génica alterada en comparación con un tejido tumoral. Así, los cultivos 2D no son el modelo más apropiado para estudiar los mecanismos celulares que se dan en un tumor. Todo esto retrasa el descubrimiento de tratamientos exitosos, ya que la mayoría de los compuestos eficaces en cultivos 2D presentan poca eficacia en los pacientes con tumores.

Los cultivos 3D: recreando características de los tumores

Los cultivos 3D solucionan gran parte de los problemas mencionados anteriormente. En ellos, las células se siembran en ausencia de una superficie adherente, con lo cual comienzan a agregarse unas sobre otras como lo harían naturalmente, formando esferas multicelulares llamadas “esferoides”.

Los esferoides se forman sobre la superficie anti-adherente de una placa de cultivo luego de sembrar las células e incubarlas durante 4 días en la estufa.

Estas esferitas que miden apenas unos micrómetros, depositan componentes de matriz extracelular (colágeno, laminina, fibronectina, elastina, etc.) y presentan comunicaciones célula-matriz y célula-célula más elaboradas que los cultivos 2D, mimetizando parte del ambiente y la arquitectura de los tumores. Además, tanto la expresión génica como la señalización celular que se genera es similar a la observada en un tumor dentro de un organismo.

Una de las aplicaciones más importantes de los cultivos en 3D es en estudios del cáncer. Los esferoides se parecen mucho a nódulos tumorales avasculares (sin vascularización, tumores en sus primeras etapas).

Gradientes metabólicos y proliferativos que se establecen en el esferoide.

En los tumores, la concentración de oxígeno, metabolitos y nutrientes disminuye a medida que se incrementa la distancia desde los vasos sanguíneos. Lo mismo ocurre en los cultivos 3D, donde las células periféricas proliferan activamente mientras que las células internas permanecen inactivas o mueren por necrosis y apoptosis. Se establece un gradiente similar para los fármacos, dificultándose su acceso a la región central de la esfera (a diferencia de un cultivo 2D en donde los fármacos afectan a toda la monocapa por igual), y esto es similar a lo que ocurre en un tumor que carece de vascularización.

De esta manera, al igual que los tumores, los cultivos 3D son más resistentes a los fármacos que los cultivos 2D, representando un modelo de estudio con mayor relevancia clínica. Muchos candidatos a nuevos fármacos pierden eficacia al pasar del cultivo 2D al 3D, lo cual permite descartar candidatos no eficaces antes de pasar a otros modelos preclínicos, como el de animales de laboratorio.

Una vez que se obtienen estas esferitas en el laboratorio, se pueden realizar diversos ensayos para evaluar si un candidato a fármaco tiene efectos beneficiosos, por ejemplo, reduciendo la proliferación o aumentando la muerte de los cultivos.

En la figura A se muestra una técnica fluorescente para observar el anillo de células proliferantes en secciones (cortes histológicos) de los esferoides. La proteína detectada en rojo solo se expresa en células que están proliferando. El azul detecta el total de células presentes en la sección. En la figura B se muestra también una técnica fluorescente para observar el centro apoptótico de un esferoide completo, utilizando una proteína que solo se expresa en las células que están muriendo por apoptosis (fluorescencia verde). El esferoide fue tratado previamente con un compuesto antitumoral, que generó gran cantidad de muerte celular, abarcando gran parte del cultivo 3D. La línea de puntos indica el borde del esferoide.

Los co-cultivos 3D: la importancia del microambiente tumoral

Ahora bien, otra cuestión a resolver en los cultivos 2D y 3D es la falta de otras células además de las tumorales. En el ambiente que rodea a un tumor (microambiente tumoral), no solo existen componentes de matriz extracelular sino también otras células que son reclutadas por el propio tumor (células endoteliales, fibroblastos, células del sistema inmune, etc.), que conforman el estroma del tumor y que participan activamente en la progresión y metástasis de los tumores y en la resistencia a fármacos.

Esto ha llevado a implementar el uso de co-cultivos o cultivos mixtos en 3D formados por líneas celulares tumorales y estromales. En estas esferas mixtas interactúan varios tipos celulares, lo que permite recrear en el laboratorio parte del microambiente de los tumores avanzados, simulando tumores más agresivos, y achicando aun más la brecha con los modelos in vivo, como los animales de laboratorio. Los co-cultivos 3D son más resistentes a los fármacos que los esferoides compuestos únicamente por células tumorales y presentan una penetración de los compuestos similar a los tejidos tumorales. Este modelo es más adecuando entonces para estudiar la respuesta a fármacos teniendo en cuenta las interacciones del tumor con su microambiente.

En el esquema se muestra, de izquierda a derecha, como se puede optimizar un cultivo 3D para acercarse a la situación de un tumor real. El co-cultivo 3D (centro) puede incluir células endoteliales (en color rojo), que simulan la red de vasos sanguíneos (en color rojo) que irrigan a un tumor vascular (derecha). En el tumor existe una mayor variedad de células estromales que en el co-cultivo. Imagen creada con BioRender.com.

Ésta es una pincelada de cuáles son las herramientas con las que cuenta la comunidad científica especializada para intentar entender cómo son los mecanismos celulares vinculados al cáncer. Paso a paso se batalla esta enfermedad que es actualmente la principal causa de mortalidad en todo el mundo.

Bibliografía y fuentes consultadas:

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Paula Ceballos

Autora: María Paula Ceballos.

Lic. en Biotecnología y Dra. en Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Rosario (UNR). Investigadora de CONICET. Con una mente curiosa e inquieta, amo investigar, disfrutando cada desafío que se presenta. Ig @paulita_ceballos

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1 comentario
  1. Elvin Estrada dice

    Espectacular. Trabajé modelos similares en mis estudios graduados. Excelente artículo.

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